Overview
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan merupakan teknik sintesis dan amplifikasi DNA dan atau RNA secara in vitro yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) serta terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda pada setiap siklusnya. Prinsip dari teknik PCR adalah memperbanyak bagian spesifik dengan enzim DNA polimerase yang diinisiasi oleh pelekatan primer dengan menghubungkan deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) dalam reaksi termal.
Komponen-komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah template DNA; sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat; dNTPs (Deoxynucleotide trifosfat); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim polimerase DNA.
Workflow
Denaturasi
Di dalam proses PCR, denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq polymerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase. Aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5 menit masing-masing pada suhu 92,5; 95 dan 97,5oC.
Annealing (Penempelan Primer)
Tahap ini merupakan tahap penempelan primer. primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa, mengandung 50 – 60% G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya lama. Sekuens DNA dalam masing-masing primer itu sendiri juga sebaiknya tidak saling berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan terbentuknya struktur sekunder pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi PCR. Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45 detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya. Kisaran temperature penempelan yang digunakan adalah antara 36o C sampai dengan 72oC, namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara 50 – 60oC.
Extention (Pemanjangan Primer)
Selama tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72oC diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target.
Gel Elektroforesa
Overview
Elektroforesis merupakan suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul. Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan listrik yang dikandung oleh makro-molekul tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen-komponen protein tersebut akan mulai bermigrasi. Pada metode elektroforesis ini, larutan penyangga yang mengandung makro-molekul, ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makromolekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose. Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan pemisahan yang lebih baik. Teknik elektroforesis ini dapt digunakan untuk beberapa analisis, diantaranya QC DNA, protein, dan enzim.
Detail Fungsi Kerja
Sample: Darah, Jaringan, Swab Buccal, Saliva, FFPE
Contoh Pemeriksaan: QC DNA, Analisis Protein, Analisis Enzim
Estimasi Pengerjaan: 1-3 Hari